在渔业养殖中微生物对环境影响严重如何治理水体中细菌群落？

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  由于水产品在人类饮食中的比重逐步的提升，水产养殖业得到迅猛进展，对水生生态环境健康带来了潜在影响。

  渔业养殖过程中施用了大量的肥料、饵料和化学药剂，使得水体和沉积物中碳、氮、磷和硫元素含量增加和积存，同时各类抗生素含量也明显提高，带来区域水体富营养化、抗生素污染等一系列环境问题.

  细菌对外界环境变化极为敏感，在有效监测养殖水体和沉积物环境质量，评价水生生态系统功能健康和维持方面均具备极其重大的地位.

  水产养殖条件下水体和沉积物中的细菌组成及优势种群存在着显著差异，其中沉积物环境比水体拥有更高的细菌丰度和多样性.

  渔业养殖可以影响水体和沉积物细菌群落结构，降低沉积物细菌多样性，并对细菌群落产生较持久的影响.

  渔业养殖促进了沉积物变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门、绿弯菌门和螺旋体菌门大规模增加，更加有助于厌氧细菌类群（如Anaerolineae纲）的生长。

  也刺激与碳循环及硫循环（如δ-变形菌）相关细菌的出现与富集.渔业养殖还促使沉积物细菌密度和生物量成倍增长，其中革兰氏阴性细菌等耐药性微生物数量显著增加.

  同时渔业养殖还导致水体环境潜在的致病菌（如弧菌）及一些病原微生物富集，导致与鱼类疾病相关的细菌类群数量持续不断的增加，进而增加了由食源性病原体引起的人类感染风险.

  而长江水系发达，所以实验选取了中下游湖泊区的菜子湖区自然湖泊，及其临近的养殖塘为水样和沉积物采样区，通过对水体和沉积物细菌高通量测序数据来进行处理与分析。

  菜子湖位于安徽省安庆市北部，南临长江.水面由菜子湖、嬉子湖和白兔湖3部分构成，合称菜子湖.湖区4－10月为丰水期，11月－翌年3月为枯水期，是长江中下游地区

  典型的浅水通江湖泊.养殖塘是在自然湖泊沿岸，通过筑厚坝围隔方式形成封闭的渔业养殖塘（图1）.

  2021年11月前期调研基础上，于2022年1月围绕菜子湖水域，分别选取4个养殖塘（F命名）及相邻或相近的自然湖泊样点（N命名）作为比照.F1和N1位于金神镇周家咀的幸福圩；F2和N2位于金神镇的王家同。

  F3和N3位于嬉子湖镇的榆咀；F4和N4位于雨坛镇的王家咀.F1、F3进行渔业养殖约有40多年，当前仍在养殖。

  自然湖泊N1~N4采样点中采集水体W1~W4，以NW命名，沉积物S1~S4，以NS命名.养殖塘F1~F4采样点中采集水体W5~W8，以FW命名，沉积物S5~S8，以FS命名.且每一个采样点均由3个混合样混合，共采集了24个水体样品和24个沉积物样品.

  水体采样利用采样器在水面下5~15cm左右采集进500mL聚乙烯无菌瓶中.一部分水样瓶中注入约0.2mL稀H2SO4溶液以抑制微生物活性，用来测定部分水体理化性质。

  另一部分（1L）先后过5μm的微孔无菌滤膜以除去大的颗粒杂物，再用0.22μm的微孔无菌滤膜以收集微生物细胞，并存放于无菌培养皿中密封后置于?18℃的冰箱中冻存用于后续的高通量测序分析.

  沉积物样品采纳抓斗式底泥采样器采集，用聚乙烯塑料袋密封编号，并在装有冰袋的冷藏箱临时储备，然后带回实验室.沉积物样品分为2份，一份进行自然风干用于理化性质分析；另一份挑出杂物后直接冷冻干燥，用于细菌高通量测序分析.

  粒度采纳贝克曼COULTERLS230型激光粒度分析仪进行测定；总氮（TN）、总硫（S）、C/N采纳德国Elementar公司生产的VarioMACROCHNS元素分析仪测定.研究区水体和沉积物样品基本理化性质见表1和表2.水体和沉积物环境质量评价采纳单因子评价方法。

  NA提取后分别采纳0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测DNA提取质量和浓度.采纳NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，应用AXYGEN公司的凝胶回收试剂盒对PCR扩增产物回收。

  以上步骤针对每个文库分别做多元化的分析.完成对所有文库的去噪后，合并ASVs特点序列和ASVs表格，并去除singletonsASVs.

  使用FAPROTAX对细菌群落功能进行猜测应用Manteltest分析检验相关性及其显著性水平，基于Bray-Curtis距离进行NMDS分析，并采纳相似度分析（ANOSIM）来评估不同组间细菌群落的差异性.以上结果绘图在R语言（R.4.1.2）中完成.

  门分类水平上，养殖塘水体和沉积物细菌群落组成与自然水体及沉积物存在一定差别（图2）.水体中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门，占比共计91.60%~94.41%。

  沉积物中变形菌门、绿弯菌门（Chloroflexi）为优势菌门，占比共计49.80%~52.36%。

  相对于NW，FW中绿弯菌门、疣微菌门（Verrucomicrobia）、蓝细菌门（Cyanobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）相对丰度明显降低，而放线菌门与螺旋体菌门（Spirochaetes）相对丰度显著升高.

  与NS相比，FS中变形菌门、酸杆菌门、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）相对丰度显著低降低，而拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、硝化刺菌门（Nitrospinae）相对丰度显著升高。

  而拟杆菌纲（Bacteroidia）、梭菌纲、δ-变形菌纲（Deltaproteobacteria）及红蝽菌纲（Coriobacteriia）相对丰度明显高于NS.以上根据结果得出渔业养殖改变了研究区水体和沉积物细菌群落组成

  NMDS分析结果为水体和沉积物各样点细菌群落组成按养殖塘与自然湖泊分别聚类，但沉积物细菌群落差异更明显（图4）。

  聚类结果的ANOSIM分析进一步表明，无论水体和沉积物，养殖塘和自然湖泊聚类结果都具有极显著性（p0.01），反映出渔业养殖显著改变了水体和沉积物细菌群落结构.

  多样性指数是各种各样的环境细菌种类丰富程度的重要指标.除水体细菌Observedspecies和Simpson指数外，养殖塘水体细菌其他多样性指数和沉积物细菌多样性指数均明显低于自然湖泊（p0.05），其中沉积物细菌Chao1、Observedspecies、Pielou、Shannon和Simpson指数达到了极显著差异水平（p0.01）（图5）.

  2个连接节点（ASV491819和ASV261302），均为变形菌门.FW关键节点总数比NW少4个，主要关键物种由变形菌门（5个）和放线个）转为放线个模块枢纽节点（ASV389844、ASV11402、ASV262458等）。

  分别属于变形菌门（9个）、酸杆菌门（4个）、硝化螺旋菌门与放线个）、厚壁菌门、拟杆菌门及芽单胞菌门（各1个）；1个连接节点（ASV411318），属于绿弯菌门（图8b）。

  FS有19个模块枢纽节点（ASV88292、ASV94688、ASV432471等），分别属于绿弯菌门（8个）、变形菌门（5个）、硝化螺旋菌门、棒状杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、放线），为硝化螺旋菌门.FS关键节点总数比NS少5个，主要关键物种由变形菌门（9个）转化为绿弯菌门（8个）.

  FS中硝化作用、好氧化学异养、好氧亚硝酸盐氧化、固氮、捕食性或寄生性等功能相对丰度明显低于NS，而发酵、铁呼吸、含硫化合物的呼吸、硫酸盐呼吸、亚硫酸盐呼吸等与硫循环相关的功能相对丰度明显高于NS（图9）.

  而FS中以化学异养、铁呼吸、含硫化合物的呼吸、硫酸盐呼吸（13个）为主.其中，NW模块0、1、2可能主要参与了化学异养、甲醇氧化与发酵功能。

  而FW模块2可能主要发挥着胞内寄生虫功能.FS模块0、1、2可能主要参与铁呼吸、含硫化合物的呼吸、硫酸盐呼吸功能。

  NS模块1中枢纽节点ASV389844参与了好氧化学异养、硝化作用功能；模块10中枢纽节点ASV11402参与化学异养与发酵功能；模块8中枢纽节点ASV262458参与了含硫化合物的呼吸与硫酸盐呼吸功能.而FW和FS关键节点与FAPROTAX各功能节点无重合，也尚不清楚这些关键节点发挥着哪些重要的功能.

  细菌群落结构上RDA分析结果与NMDS分析结果相似，渔业养殖下水体和沉积物细菌群落结构与自然湖泊存在很明显差异.RDA分析进一步表明pH是影响研究区水体细菌群落结构的最主要解释因子，累积解释量为17.5%（p=0.012），而EC和TP分别为9.4%和9.0%（p0.05）.

  本研究区除养殖塘水体pH明显高于自然湖泊外，其他所测水体理化性质指标未有显著性差异，但沉积物有效氮、全磷、有效磷和硫含量均明显高于自然湖泊.

  水体和沉积物pH、COD、氮、磷和硫化物等物理化学性质影响着细菌群落组成，有研究表明污水排放可导致河流沉积物δ-变形菌纲和厚壁菌门增加，而γ-变形菌纲和疣微菌门降低.

  渔业养殖显著改变了水体和沉积物细菌群落结构，偏好富营养和耐对环境造成污染的厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门相对丰度提升，水体中如螺旋体门类病原菌相对丰度也升高.同时养殖塘水体和沉积物细菌多样性降低，表明养殖塘环境细菌群落结构稳定性下降.

  养殖塘环境细菌群落结构稳定性降低和功能潜势变化，尤其病原菌细菌丰度提高，启发人们在渔业养殖过程中应减少过量营养的东西和化学药剂输入，以减少对养殖塘环境微生物的影响，有利于构建健康、绿色和ECO稳定的水产养殖环境.